提取高濃度、大片段、多樣性程度高、具有代表性的土壤微生物總DNA對土壤微生物多樣性研究至關重要。然而，土壤是一個非常復雜的異質(zhì)體系，其中含有的腐植酸及腐植酸類似物、酚類化合物、重金屬離子等，在DNA提取過程中如不能有效去除，將直接影響后續(xù)的PCR擴增、核酸雜交、內(nèi)切酶消化等分子操作。
用傳統(tǒng)微生物學方法對復雜微生物生態(tài)系統(tǒng)進行研究必須首先進行微生物的分離培養(yǎng)。由于土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)極為復雜及培養(yǎng)條件的限制，可在實驗室培養(yǎng)的微生物還不到土壤微生物總數(shù)的1％，相當多的微生物因無法人工培養(yǎng)而未被認識[1]。
土壤微生物DNA的提取純化是一個耗時、繁瑣的過程，許多學者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。20世紀80年代中期以來，微生物學家開始采用免培養(yǎng)分子微生物生態(tài)學法直接對土壤微生物進行研究[2]，其方法必須提取土壤微生物群落的DNA。Volossiouk[3]等使用液氮研磨及SDS(十二烷基磺酸鈉)破解微生物細胞提取土壤DNA，Tsai[4]等則采用溶菌酶和SDS法提取土壤DNA，而這些方法所提取的DNA雜質(zhì)較多，嚴重影響后續(xù)研究結果[5-6]。后來，Bourrain等[7]從活性污泥中以及LaMontagne等[8]從堆肥中提取了微生物群落的DNA。但是，目前仍然沒有一種快速、高效、低成本且高質(zhì)量的土壤DNA提取方法。本文購買了市面上常用的土壤DNA試劑盒，就提取效果進行了對比。
用于DNA提取的土壤樣品采自無錫市惠山區(qū)惠山中央公園草坪的貧瘠土(1～10 cm表土；樣品編號1)、池塘邊的活性污泥（樣品編號2），以及小樹林的腐殖土(1～10 cm表土；樣品編號3)。
設置三個實驗組：
（A）O公司 （Lot. M****-02）；
（B）M公司 （Lot.***545）；
（C）Bioteke （貨號：AU46112）.
嚴格按照試劑盒步驟提取土壤DNA，比較不同試劑盒處理的DNA提取效率，并通過凝膠電泳和PCR擴增分別確定不同試劑盒提取后DNA的提取量及擴增16S rRNA基因的可行性。
用細菌通用引物對27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' PCR擴增不同處理后提取的土壤和活性污泥微生物群落中的16S rRNA基因。PCR循環(huán)為：94℃，3 min，1次循環(huán)；94℃，30 s，30次循環(huán)；55℃，30 s，30次循環(huán)；72℃，1 min，30次循環(huán)；72℃，5 min，1次循環(huán)。
圖2 土壤樣品16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)品電泳圖
1.A組提取的DNA鹽度尚可，但是含有的PCR干擾因子較多，PCR擴增不出條帶；
2. B組三種土壤有提取的核酸只有兩種滿足PCR條件；
3.C組土壤提取試劑盒提取的土壤DNA，鹽殘留少，純度高，提取的DNA中PCR抑制因子低，提取出的DNA可正常擴增，條帶單一且清晰。
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[8]Lamontagne M G, Jr M F, Holden P A, et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis.[J]. Journal of Microbiological Methods, 2002, 49(3):255-264.
