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1.引言

提取高濃度、大片段、多樣性程度高、具有代表性的土壤微生物總DNA對(duì)土壤微生物多樣性研究至關(guān)重要。然而，土壤是一個(gè)非常復(fù)雜的異質(zhì)體系，其中含有的腐植酸及腐植酸類似物、酚類化合物、重金屬離子等，在DNA提取過程中如不能有效去除，將直接影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增、核酸雜交、內(nèi)切酶消化等分子操作。

用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法對(duì)復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究必須首先進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)。由于土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)極為復(fù)雜及培養(yǎng)條件的限制，可在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物還不到土壤微生物總數(shù)的1％，相當(dāng)多的微生物因無法人工培養(yǎng)而未被認(rèn)識(shí)^[1]。

土壤微生物DNA的提取純化是一個(gè)耗時(shí)、繁瑣的過程，許多學(xué)者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。20世紀(jì)80年代中期以來，微生物學(xué)家開始采用免培養(yǎng)分子微生物生態(tài)學(xué)法直接對(duì)土壤微生物進(jìn)行研究^[2]，其方法必須提取土壤微生物群落的DNA。Volossiouk^[3]等使用液氮研磨及SDS(十二烷基磺酸鈉)破解微生物細(xì)胞提取土壤DNA，Tsai^[4]等則采用溶菌酶和SDS法提取土壤DNA，而這些方法所提取的DNA雜質(zhì)較多，嚴(yán)重影響后續(xù)研究結(jié)果^[5-6]。后來，Bourrain等^[7]從活性污泥中以及LaMontagne等^[8]從堆肥中提取了微生物群落的DNA。但是，目前仍然沒有一種快速、高效、低成本且高質(zhì)量的土壤DNA提取方法。本文購(gòu)買了市面上常用的土壤DNA試劑盒，就提取效果進(jìn)行了對(duì)比。

2.材料與方法

2.1材料

用于DNA提取的土壤樣品采自無錫市惠山區(qū)惠山中央公園草坪的貧瘠土(1～10 cm表土；樣品編號(hào)1)、池塘邊的活性污泥（樣品編號(hào)2），以及小樹林的腐殖土(1～10 cm表土；樣品編號(hào)3)。

2.2方法

2.2.1 分組

設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組：

（A）O公司 （Lot. M****-02）；

（B）M公司 （Lot.***545）；

（C）Bioteke （貨號(hào)：AU46112）.

2.2.2 DNA提取

嚴(yán)格按照試劑盒步驟提取土壤DNA，比較不同試劑盒處理的DNA提取效率，并通過凝膠電泳和PCR擴(kuò)增分別確定不同試劑盒提取后DNA的提取量及擴(kuò)增16S rRNA基因的可行性。

2.2.3 PCR擴(kuò)增

用細(xì)菌通用引物對(duì)27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' PCR擴(kuò)增不同處理后提取的土壤和活性污泥微生物群落中的16S rRNA基因。PCR循環(huán)為：94℃，3 min，1次循環(huán)；94℃，30 s，30次循環(huán)；55℃，30 s，30次循環(huán)；72℃，1 min，30次循環(huán)；72℃，5 min，1次循環(huán)。

3.結(jié)果與分析

3.1提取的DNA濃度及完整性的對(duì)比結(jié)果

圖2 土壤樣品16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)品電泳圖

3.2提取的DNA濃度及完整性的對(duì)比結(jié)果分析

1.A組提取的DNA鹽度尚可，但是含有的PCR干擾因子較多，PCR擴(kuò)增不出條帶；

2. B組三種土壤有提取的核酸只有兩種滿足PCR條件；

3.C組土壤提取試劑盒提取的土壤DNA，鹽殘留少，純度高，提取的DNA中PCR抑制因子低，提取出的DNA可正常擴(kuò)增，條帶單一且清晰。

4. 參考文獻(xiàn)

[1]Torsvik V L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems[J]. Current Opinion in Microbiology, 2002, 5(3):240-245.

[2]Head I M, Saunders J R, Pickup R W. Microbial Evolution, Diversity, and Ecology: A Decade of Ribosomal RNA Analysis of Uncultivated Microorganisms[J]. Microbial Ecology, 1998, 35(1):1-21.

[3]Volossiouk T, Robb E J, Nazar R N. Direct DNA extraction for PCR-mediated assays of soil organisms.[J]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(11):3972-3976.

[4]Tsai Y L, Olson B H. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments.[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1991, 57(4):1070-4.

[5] Bürgmann H, Pesaro M, Widmer F, et al. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil[J]. J Microbiol Methods, 2001, 45(1):7-20.

[6]王嘯波, 唐玉秋, 王金華,等. 環(huán)境樣品中DNA的分離純化和文庫構(gòu)建[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2001, 41(2):133-140.

[7]Bourrain M, Achouak W, Urbain V, et al. DNA Extraction from Activated Sludges[J]. Current Microbiology, 1999, 38(6):315-319.

[8]Lamontagne M G, Jr M F, Holden P A, et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis.[J]. Journal of Microbiological Methods, 2002, 49(3):255-264.